近日，宁波大学联合浙江大学团队在《Pest Management Science》在线发表了题为″Nematicidal azaphilones from the mesophotic sponge-associated fungus Eutypellasp. NBUF234″的研究论文，报道了来源于中光层海绵共附生真菌的杀线虫嗜氮酮新天然产物。
植物寄生线虫是全球农林业生产面临的重大生物灾害，其中松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus，PWN）是松材线虫病的病原，可导致感病松树在数周内迅速枯死，被称为松树的″癌症″；大豆孢囊线虫（Heterodera glycines，SCN）则是全球大豆生产上危害最严重的病原之一，其孢囊内的卵可在土壤中存活多年，增加了持续防控的难度。目前化学防治是控制植物寄生线虫的重要手段之一，但部分现有杀线虫剂的应用仍面临环境与非靶标风险等限制，具有全新作用机制的低毒杀线虫小分子亟待发现。中光层（30 ~ 150米）具有独特的生物资源，其生物合成潜力迄今仍未得到充分挖掘。
研究团队长期聚焦这一独特生境中海绵共附生真菌的活性次生代谢产物发掘，从采自西沙群岛海域、深度71.8米的Cinachyrella属海绵共附生真菌Eutypella sp. NBUF234中，分离鉴定出三个结构新颖的嗜氮酮型化合物eutylones A–C（1–3），并系统评价了其对松材线虫和大豆孢囊线虫的杀线虫活性及化合物2的初步作用机制。
1. 发现结构新颖的嗜氮酮化合物，拓展deflectin型骨架多样性
研究团队综合运用波谱学分析、X射线单晶衍射及量子化学计算等手段，确证了化合物1–3的平面结构与绝对构型，将其命名为eutylones A–C。其中，化合物1为已知异色烯衍生物的C-8a差向异构体，其（7S,8S,8aR）绝对构型经单晶X射线衍射实验确证。化合物2和3属于deflectin型嗜氮酮，是该类天然产物中首次发现同时带有C-5甲基取代和C-8位独特侧链结构的成员（图1）。这一发现丰富了deflectin型嗜氮酮天然产物的结构多样性，也为该骨架类化合物的生源途径研究提供了新的分子实例。
图1 化合物1−3化学结构
2. 化合物1–3对松材线虫和大豆孢囊线虫均表现出中等、剂量依赖的体外杀线虫活性
体外杀线虫活性测定结果显示，化合物1–3处理72小时后，对松材线虫和大豆孢囊线虫的死亡率均呈现明显的剂量依赖关系。化合物2和3对松材线虫的估计半数致死浓度（LC50）分别为145.8 μM和90.3 μM，化合物3表现出更低的LC50数值；二者对大豆孢囊线虫的估计LC50则较为接近，分别为159.1 μM和159.6 μM，置信区间存在重叠（图2）。研究团队指出，因未开展正式的剂量‑反应曲线统计学比对，目前尚不能判断上述半数致死浓度估计值的差异是否具有统计学显著性。在三种人源细胞系（HEK293T、HaCaT及MRC-5）的24小时体外测试中，化合物2在最高200 μM的测试范围内均未达到细胞毒性IC50，提供了初步细胞毒性信息，其选择性和安全性仍需进一步评价。
图2 化合物1−3对松材线虫（左）及大豆孢囊线虫二龄幼虫（右）的体外剂量依赖性杀线虫活性，死亡率于处理72小时后测定。
3. 转录组分析结合分子对接及RNA干扰实验，提示CAG9107488.1可能参与化合物2的杀线虫响应
由于化合物2在早期筛选中显示出较好的活性，研究团队以其为代表分子，通过比较转录组测序、蛋白质组尺度分子对接及RNA干扰等手段，对其在两种线虫中的响应机制开展了探索性研究。转录组结果显示，化合物2处理分别诱导松材线虫175个（98个上调、77个下调）和大豆孢囊线虫20个差异表达基因；功能富集分析表明，松材线虫的响应涉及细胞骨架重塑、角质层形成与蜕皮等结构相关过程。大豆孢囊线虫在统一的严格校正P值阈值下未获得统计学显著的GO或KEGG富集条目，但人工功能注释提示，部分差异表达基因与细胞色素P450、谷胱甘肽代谢等解毒相关过程有关，提示两种线虫可能存在不同的转录响应。在此基础上，研究团队开展了覆盖两种线虫合计38,202个蛋白条目的蛋白质组尺度虚拟对接筛选，并将对接打分与差异表达基因信息整合，优先筛选出血管紧张素转换酶同源蛋白CAG9107488.1作为松材线虫中的候选作用蛋白（对接打分-11.56 kcal/mol）。RNA干扰实验降低了该基因的表达，并提示其可能参与松材线虫对化合物2的致死响应，为后续作用机制研究提供了初步功能线索（图3）。研究团队同时强调，该结果尚不能证明化合物2与CAG9107488.1之间存在直接物理结合，仍需表面等离子体共振、细胞热位移分析等实验予以验证。
图3 CAG9107488.1的RNA干扰验证及敲低背景下松材线虫对化合物2的死亡率响应
该项工作显示，中光层海绵共附生真菌是发掘结构新颖杀线虫活性化合物的重要资源库，eutylones A–C的发现为深入认识嗜氮酮天然产物的构效关系提供了新的分子模板。上述转录组学、分子对接与RNA干扰研究结果共同构建了化合物2潜在作用机制的可检验假说，但相关机制解析目前仅针对化合物2开展，相关结论尚不能直接推广至对松材线虫具有较低LC50点估计值的化合物3。研究团队认为，这些结构新颖的化合物应被视为可供后续结构优化的起始骨架，而非已验证的先导杀线虫剂，后续仍需开展侧链结构改造、构效关系研究及靶标验证等工作。
论文链接：https://doi.org/10.1002/ps.71294
来源: 公众号：线虫学研究前沿
