近日，中国农业科学院生物技术研究所饲草作物功能基因组创新团队开发了紫花苜蓿高效引导编辑技术体系，并创制了耐双除草剂紫花苜蓿新种质，为饲草绿色轻简化栽培和分子育种提供了重要技术工具与种质资源。相关研究成果发表在《植物生物技术杂志（Plant Biotechnology Journal）》上。
紫花苜蓿是全球栽培面积最大的豆科饲草作物，蛋白质含量高、氨基酸组成均衡，素有"牧草之王"之称。杂草危害贯穿苗期建植与刈割后再生等关键阶段，是制约苜蓿产量与品质的主要因素，杂草防控因此成为紫花苜蓿生产中的关键环节。然而，生产上抗除草剂苜蓿品种匮乏，长期单一施用除草剂又易诱导杂草抗药性演化，并带来土壤残留风险。创制新型多抗除草剂紫花苜蓿种质，对提升饲草产量与品质、降低田间管理成本、推进产业绿色可持续发展具有重要意义与应用前景。
研究团队对升级版引导编辑系统ePPEplus进行适配性改造，将驱动编辑核心元件的玉米Ubiquitin启动子分别替换为双CaMV 35S启动子和来源于豆科作物大豆的M4启动子，构建了适用于紫花苜蓿的引导编辑系统。毛状根测试表明，M4启动子可显著提高编辑元件nCas9的积累水平，其驱动的系统在MsALS1、MsALS2和MsACC1三个靶位点的等位基因编辑频率分别达到1.76%、1.23%和0.29%，而双35S启动子版本几乎检测不到目标编辑，证实增强核心元件表达是提升紫花苜蓿引导编辑效率的关键。
在此基础上，研究团队借助Csy4核酸酶系统实现多条引导RNA的同步表达，对MsALS1（W554M）、MsALS2（W559M）及MsACC1（W1961C）三个保守功能位点同时定点突变——其中MsALS1/MsALS2突变模拟水稻同源基因中赋予ALS抑制剂类除草剂广谱抗性的W548M突变，MsACC1突变对应赋予芳氧苯氧丙酸酯类除草剂抗性的W2125C突变。通过农杆菌介导转化主栽品种"中苜1号"，研究团队在719株T0代转基因阳性植株中，分别鉴定出MsALS1、MsALS2、MsACC1位点目标编辑植株8株（1.11%）、13株（1.81%）和1株（0.14%），编辑类型涵盖单等位、双等位及多基因组合编辑。其中284号株系同时携带MsALS1、MsALS2双等位编辑和MsACC1单等位编辑，且各突变不影响植株正常生长发育。
除草剂抗性鉴定显示，在200毫克/升烟嘧磺隆处理下，野生型植株出现大面积叶片黄化、萎蔫与坏死，生长近乎停滞，而284号株系表现近乎完全的抗性，叶片浓绿、叶绿素含量正常、生长旺盛；在648毫克/升高效氟吡甲禾灵处理下，野生型叶片严重卷曲坏死，284号株系仅少数叶片边缘轻微坏死，表现明显耐受性。研究还发现，MsALS1是介导烟嘧磺隆抗性的主效基因，MsALS1与MsALS2之间呈剂量依赖的加性效应。
综上，该研究首次在紫花苜蓿中建立引导编辑技术体系并实现多基因同步编辑，创制出兼具烟嘧磺隆高抗性与高效氟吡甲禾灵耐受性的紫花苜蓿新种质，为饲草绿色轻简化栽培和分子育种提供了重要技术工具与优异种质资源。
论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70752
