多杀菌素发酵与纯化工艺优化，产量和纯度显著提升

摘自：《山西化工》2025（03）

作者：张小凤; 刘峰; 倪为贵（山东合成远景生物科技有限公司公司）

多杀菌素是一种高效、低毒的生物农药，广泛应用于农业害虫防控。本文通过优化氧传递及智能补料策略，提高多杀菌素合成效率，采用EtOAc-AcN萃取结合HILIC层析，提高回收率及产品纯度，并结合在线监测及智能控制优化发酵参数，提高生产稳定性，为工业化生产提供技术支持。

一、多杀菌素发酵工艺研究

多杀菌素的高效发酵生产涉及多个关键技术环节，包括发酵参数的优化、氧传递效率提升、代谢流调控以及生物反应器在线监测。本研究采用分批补料（Fed-batch）模式控制底物浓度，避免葡萄糖效应（catabolite repression），提高目标产物合成。

本研究选用的多杀菌素生产菌株为Saccharopolyspora spinosa ATCC 49460，购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。实验采用标准的微生物发酵及生物分离纯化流程，包括种子培养、发酵生产、菌体收集、细胞破碎、多杀菌素提取、纯化及HPLC检测。

溶氧传递与搅拌优化

溶氧（DO值）是多杀菌素合成的限制因素之一，较低的溶氧浓度会影响Saccharopolyspora spinosa的次级代谢途径，降低目标产物的积累。本研究采用氧传递系数（kLa）模型评估通气速率（QO2）与搅拌速率（N）的影响。初始设定DO值为30%，通气速率0.5 VVM，在发酵中期（48 h)DO下降至15%以下，导致多杀菌素产量下降15%。通过增大通气量至1.2 VVM，同时调整搅拌速率至400 r/min,kLa值从15 h-1提高至28 h-1，氧传递能力提高86.7%，多杀菌素产量提升23.4%。

pH动态控制

多杀菌素合成过程中，代谢中间产物的积累会引起p H波动，影响菌体生长及产物分泌。本研究采用在线pH自动控制系统，通过NaOH(1 mol/L）或HCl(0.5 mol/L）补偿发酵液pH变化，确保pH始终维持在7.0±0.2。发酵后期（96 h后），若pH持续下降至6.5以下，发现菌体生长受抑，发酵液中乙酸、丙酸等副产物浓度升高，表明糖代谢向酸性副产物偏移。调整pH设定值至7.2，副产物浓度降低27%，多杀菌素产量提高12%。

在线监测与智能控制

本研究采用BIOSTAT Cplus发酵罐自带的pH-DO在线传感器，结合LabVIEW数据采集系统，记录菌体生长曲线及代谢参数，并通过PID控制算法进行参数调整。数据分析显示，在优化通气-搅拌及底物补料后，多杀菌素的比生长速率（μ）提高0.07 h-1，菌体生物量提升26%，整体发酵周期缩短12 h，生产效率提升21%。

二、多杀菌素纯化工艺研究

多杀菌素的提取与纯化涉及细胞破碎、溶剂萃取、层析分离、色谱精制等关键技术。本研究优化了超声破碎参数、液液萃取溶剂体系、柱层析纯化条件，确保产品的高纯度及高回收率。

超声细胞破碎技术

多杀菌素为胞内次级代谢产物，需要有效的细胞破碎方法释放目标产物。本研究比较了高压匀浆法（HPH）、珠磨破碎法、超声破碎法三种方法，结果显示超声破碎的蛋白泄露量最低（0.45 g/L），目标产物损失最少。优化的破碎参数为950 W，频率20 kHz，间歇模式（5 s开/5 s关），处理时间20 min，破碎效率提高37%，回收率提高14%。

溶剂萃取与相平衡优化

采用等体积乙酸乙酯萃取两次，初步提取目标产物。但考虑到水相中多杀菌素的溶解性，本研究引入相平衡优化（Partition Coefficient Optimization），调整水-有机相比例（体积比1∶1.2），提高萃取效率。优化后多杀菌素的分配系数（Kp）从2.8提高至4.6，单次萃取回收率从67%提高至81%。

质量控制与稳定性评价

最终产品通过质谱（LC-MS）、核磁共振（NMR）进行结构确证。样品在4℃贮存6个月，纯度降低0.5%，相对稳定。优化工艺后，总回收率从75.2%提高至85.6%，有效提高了工业生产的经济性。

三、结论

本研究通过优化多杀菌素发酵与纯化工艺，实现了产量和纯度的显著提升。发酵阶段采用碳氮比14.0、DO值为50%、搅拌速度400 r/min、通气1.5 VVM的优化策略，使多杀菌素产量提高至620 mg/L，糖消耗速率提升87.5%，发酵周期缩短12 h。纯化过程中，EtOAc-AcN萃取体系提高目标产物回收率至85.6%,HILIC柱层析结合HPLC精制使最终纯度达97.2%，总回收率提升至90.5%。优化后的工艺在产量、纯度及收率方面均优于传统方法，并具备工业化放大的可行性。

来源: 山西化工-CNKI