近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由先正达北京创新中心梁大伟团队撰写的"A robust framework for maize elite line genome editing through enhanced HI-Edit via LbCas12a activity optimization"论文。该研究工作通过系统优化，成功实现了LbCas12a介导的玉米HI-Edit（单倍体诱导耦合基因编辑）；并通过优化Cas12a蛋白在生殖细胞中的表达水平、蛋白稳定性及单倍体诱导过程中环境温度，将该技术应用的核心瓶颈—玉米单倍体编辑效率（HER）从平均不足2%提升至最高33%。研究团队报道的这一套基于保守生物学过程HI-Edit技术策略，为玉米优良种质的直接基因编辑改良提供了明确的技术方案和路径，有望彻底改变传统育种中优良品种难转化、改良耗时长成本高的局面。
传统遗传改良中，将一个优良性状（如糯性、抗病性）通过回交转育导入商业品种，通常需要5-8年的漫长周期。而且，大多数商业优良品种无法直接进行遗传转化—同一物种的不同基因型之间，转化效率可能相差数十倍甚至上百倍，这使得大量优质种质资源无法直接进行基因编辑改良。2019年，先正达团队开创性地提出了HI-Edit（Haploid Induction coupled with Genome Editing） 概念：利用一个携带基因编辑工具的父本单倍体诱导系与目标商业品种杂交，在诱导产生单倍体的同时完成对目标品种基因组的编辑（图1a）。由于整个过程不涉及组织培养和遗传转化，HI-Edit从原理上绕过了品种依赖性的瓶颈。然而，这一技术在应用时面临两个关键障碍：（1）基因编辑工具导入单倍体诱导系难。Stock 6 来源的单倍体诱导系无法进行遗传转化或效率极低，如何高效快速地将基因编辑工具（CRISPR/Cas）导入单倍体诱导系成为HI-Edit应用的第一个难题。先正达研究团队通过诱导系育种改良及转化体系优化，培育出新型可直接遗传转化的单倍体诱导系，解决了基因编辑工具高效导入的问题（Delzer et al., 2024）。(2) HI-Edit过程中单倍体编辑效率（HER）低，平均值仅为1%-7%（Kelliher et al., 2019; Li et al., 2025; Wang et al., 2019），这种低效率使得HI-Edit在商业化推广中成本高昂、难以规模化应用。先正达北京创新中心梁大伟及其团队基于单倍体诱导的生物学过程及基因编辑工具在此短暂时间窗口内的功能最大化，进行针对性设计及优化，建立了一套高效、可扩展的增强型HI-Edit技术流程（图1a、1b），全文主要研究结果如下：
图1 HI-Edit技术原理、实施流程及评价指标
1. 雄性配子/合子启动子的发现与单倍体编辑验证
HI-Edit的编辑窗口极为短暂。在玉米中，受精发生后，诱导系基因组通常在48小时内、历经一到两次细胞分裂后便被主动清除（Kelliher et al., 2017; Marimuthu et al., 2021）。基因编辑工具必须在精子细胞与卵细胞融合后、诱导系基因组被清除之前的这一狭小窗口内完成对靶基因的修饰。如果编辑工具的表达量不足，或者表达时空不匹配，母本基因组的编辑就无从发生。研究者首先通过分析玉米和水稻的精子细胞及早期合子转录组数据（Chen et al., 2017; Anderson et al., 2017）及外源强组成型启动子，筛选出在生殖发育关键时期高表达的候选启动子（图2a），结合表达分析及合子编辑效率测试，最终锁定prZmVSP, prZmRZDP和prSoUbi4在精子细胞和早期合子中具有强活性的启动子。利用这些启动子驱动优化的LbCas12a变体（LbCas12aV）进行HI-Edit验证（图2b、2c），在与不同玉米种质杂交后，获得的单倍体群体（图2d，2e）中均成功实现了目标基因的编辑（图2f，2g）。研究者共筛选了35个T0阳性转化事件，从1,207个F1果穗中分离出189,966个胚，最终鉴定出23,068个单倍体，平均单倍体诱导率（HIR）为12.14%；靶向Waxy1（Wx1）的HER最高达到7.5%，靶向Glossy2（Gl2）的HER最高达到2.3%（图2i）。所有检测到的突变均为2-82bp的缺失，其中63.6%为小于15bp的缺失。这一效率已与早期Cas9介导的HI-Edit报道相当甚至更高。更重要的是，通过检测F1二倍体胚胎中的编辑情况（即合子编辑率ZER），研究者发现ZER与HER之间存在良好的正相关关系（R²=0.65-0.70），这意味着可以利用T0代的ZER 测试数据对转事件体进行评估筛选，选出的高效转化体用于后续大规模杂交、及单倍体筛选，从而避免了大规模杂交的盲目性，大大节约了技术应用的成本。此外，研究者还发现多拷贝转化事件介导的平均HER（2.1%）高于单拷贝事件（0.77%）。以上结果说明，筛选雄性配子/合子特异性高表达启动子能够有效提升HI-Edit中编辑工具的精准时空表达，为高效编辑奠定分子基础。
图2 LbCas12aV介导的HI-Edit及其启动子优化效果
2. 授粉后热处理提升单倍体编辑效率
LbCas12a来源于Lachnospiraceae细菌，其最优酶活温度为35-37°C，高于常规植物生长温度。研究者据此提出大胆假设：父本诱导系雄配子携带编辑工具与母本基因组融合后进行适度热处理，可提升Cas12a在合子中酶活，进而提高编辑效率。为此，团队开发了一套简易的果穗热处理方法。在授粉后10小时（父、母配子融合的大致时间）开始，用化学发热包包裹玉米雌穗，使穗部温度维持在35°C持续36小时（图3b、3c），对照组则置于常规温室条件下（25-30°C昼/16-20°C夜）。研究共评估了来自6个载体的19个转化事件在热处理条件下的HI-Edit效率。结果令人振奋。在热处理试验组中，靶向Wx1的平均HER从对照的0.76%（Tester 1）和1.52%（Tester 2）分别跃升至2.13%和9.15%，最高单事件HER达到19.1%（图3e）。对于更难编辑的Gl2靶点，效果更为显著——热处理使平均HER分别提升了11倍（Tester 1）和12倍（Tester 2），最高值分别达到5.71%和7.27%。单倍体的多位点被编辑事件在热处理组中也显著提高（共检出32个双重编辑单倍体），而对照组仅检出4个。一个简单的热处理操作，使编辑效率实现了数量级的跃升！为进一步优化热处理方法及其对结实率的负面影响，作者开发了hot water pack方法，该方法更加精确、稳定；利用该方法作者优化了热处理起始时间、温度和持续时间，最终确定了33°C处理36小时、从授粉后10小时开始为最佳方案。在该条件下，平均HER达到16%，结实率维持在对照的86%，每穗可获得2.4个编辑单倍体（图3f、3g）。值得注意的是，35°C处理虽然能进一步提升HER（最高可达23%），但会导致结实率下降超过67%，因此33°C是在效率和产出之间取得的最佳平衡点。机制探究表明，热处理还可提升了LbCas12aV的转录水平（约1倍，图3i）；另外，热处理可能通过诱导染色质松弛、增加靶点可及性来促进编辑发生。花粉DAPI染色显示，热处理后精细胞核体积明显增大（图3h）。以上结果说明，单倍体诱导过程中适度热处理可提升Cas12a转录水平、活力及染色质开放程度，进而显著提高HI-Edit单倍体编辑效率，是一种操作简便、成本低廉且效果显著的优化策略。
图3 热处理显著提升HI-Edit效率
3. UBA2融合提升单倍体编辑效率
Cas蛋白在植物细胞中可能被泛素-蛋白酶体系统快速降解，在常规的稳定转化编辑中，持续的转录可以补偿蛋白的不稳定性。作者提出假设：在HI-Edit短暂编辑窗口（携带Cas的诱导系基因组快速丢失）背景下，提高Cas12蛋白稳定性（维持细胞内存留时间）可提高HI-Edit单倍体编辑效率（HER）。团队借鉴了此前在植物中验证过的设计—将拟南芥蛋白RAD23的UBA2结构域融合到LbCas12aV的C端（图4a）。UBA2结构域能够保护融合蛋白免受蛋白酶体的降解，从而延长其在细胞内的存留时间（Heessen et al., 2005; Jang et al., 2012; Zheng et al., 2020）。实验结果显示，在常温条件下，UBA2融合使靶向Wx1的平均单倍体编辑效率（HER）从对照的0.37%（Tester 1）和1.06%（Tester 2）分别跃升至3.97%和7.90%，整体提升约6倍；靶向Gl2的HER提升了约4.5倍（图4b）。UBA2融合对HER的提升幅度远高于此前在水稻稳定转化编辑中报道的效果，可能是因为HI-Edit的编辑窗口极为短暂，蛋白稳定性增加的效果更显著。作者进一步测试了UBA2融合与热处理的协同效应，在热处理条件下，UBA2融合载体靶向Wx1的平均HER达到25.2%（范围在16.5%-33%之间），是常温对照的15倍（图4b）。其中表现最优的事件在Tester 2背景中实现了33%的HER——这意味着平均每三个单倍体中就有一个携带目标编辑。质谱定量分析证实，UBA2融合使Cas12a蛋白的含量提高了约26%（280.72 fmol/µg提升至353.67 fmol/µg）。以上结果说明，UBA2融合通过延长Cas蛋白在植物细胞的存留时间，显著提升了HI-Edit的编辑效率，且与热处理存在协同效应。
图4 UBA2融合显著提升单倍体编辑效率
这项研究开发增强型HI-Edit技术框架，不仅展示了通过系统优化编辑工具表达、稳定性和环境条件来突破HI-Edit效率瓶颈的有效路径，也揭示了多项优化策略之间的协同叠加效应，为玉米优良种质的直接基因编辑改良提供了明确的技术路径和高产出的方案。这一框架的建立，标志着HI-Edit从技术可行向商业化应用迈出了关键一步，也为其他作物中HI-Edit技术的优化提供了可借鉴的方法论。
论文链接： https://doi.org/10.1111/pbi.70715
先正达北京创新中心梁大伟、郭欢欢、魏娟为该论文共同第一作者，梁大伟、陈希、Rachel Egger为该研究工作共同通讯作者。
参考文献：
Brent, D., D. Liang, D. Szwerdszarf, et al. (2024). Elite, Transformable Haploid Inducers in Maize. Crop J. 12: 314–319.
Kelliher, T. et al. (2019) One-step genome editing of elite crop germplasm during haploid induction. Nat. Biotechnol. 37: 287-292.
Kelliher, T. et al. (2017) MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction. Nature 542: 105-109.
Li, L. et al. (2025a) Harnessing haploid-inducer mediated genome editing for accelerated maize variety development. Plant Biotechnol. J. 23: 1604-1614.
Wang, B. et al. (2019) Development of a Haploid-Inducer Mediated Genome Editing System for Accelerating Maize Breeding. Mol. Plant 12: 597-602.
Zheng, X. et al. (2020) The Improvement of CRISPR-Cas9 System With Ubiquitin-Associated Domain Fusion for Efficient Plant Genome Editing. Front. Plant Sci. 11: 621.
Chen, J. et al. (2017) Zygotic Genome Activation Occurs Shortly after Fertilization in Maize. Plant Cell 29: 2106-2125.
Anderson, S.N. et al. (2017) The Zygotic Transition Is Initiated in Unicellular Plant Zygotes with Asymmetric Activation of Parental Genomes. Dev Cell 43: 349-358.
Heessen, S. et al. (2005) The UBA2 domain functions as an intrinsic stabilization signal that protects Rad23 from proteasomal degradation. Mol. Cell 18: 225-235.
Jang, I.C. et al. (2012) Enhancing protein stability with retained biological function in transgenic plants. Plant J. 72: 345-354.
Marimuthu, M.P.A. et al. (2021) Epigenetically mismatched parental centromeres trigger genome elimination in hybrids. Sci. Adv. 7: eabk1151.
来源: 公众号：植物生物技术Pbj
