中国农大赖锦盛教授团队开发新型Type I-C CRISPR编辑系统，成功实现玉米基因组编辑

近年来，CRISPR-Cas技术的快速发展为植物基因组精准改良提供了重要技术支撑。目前，大多数基因组编辑主要依赖Cas9、Cas12等CRISPR系统。相比之下，Type I CRISPR系统能够利用多个亚基组成的Cascade复合物以及Cas3蛋白识别目标DNA，并介导其连续降解，从而进行大片段缺失。在Type I多个亚型中，Type I-C系统基因座结构更为紧凑，能够诱导DNA单向、连续降解，其较宽的编辑窗口也为开发用于饱和突变的碱基编辑器提供可能。尽管Type I-C系统存在上述优势，但目前在植物中仅有Dvu I-C被证实能够实现高效基因敲除，且基于Type I-C系统开发的植物碱基编辑器尚未见报道。

近日，中国农业大学赖锦盛教授团队在The Crop Journal在线发表了题为″Systematic mining identifies two Type I-C CRISPR systems for efficient genome editing in maize″的研究简报。该研究对Type I-C CRISPR编辑系统进行了系统挖掘，鉴定出两个具有真核编辑活性的新型Type I-C系统——Aca I-C和Cja I-C，并展示了其在玉米中实现基因敲除及单碱基编辑的潜力，有效拓展了植物基因组编辑工具。

为了挖掘更多的Type I-C系统，研究团队建立了一套挖掘流程，对来自JGI/IMG和NCBI数据库的约10.35 TB公共数据进行系统分析。通过结合CRISPR array鉴定、Cas3蛋白同源性和结构域分析以及特征蛋白Cas8c筛选等策略，从约170万个CRISPR array中成功鉴定获得4258个Type I-C系统 (图1A)。进一步的生态分布分析发现，上述Type I-C系统广泛存在于18类不同的生态环境中，并在厌氧环境、消化系统等10类环境中显著富集。其中厌氧环境中Type I-C系统的富集程度是宏基因组背景水平的5.2倍 (图1B)。这说明上述环境可能是Type I-C系统的重要资源库。通过随机宏基因组取样进行的饱和度分析揭示，在人为影响环境、实验室培养体系、微生物群落以及土壤和沉积物环境中，曲线仍持续上升，表明这些环境中可能仍存在大量尚未被鉴定的新型Type I-C系统 (图1C)。随后，研究团队筛选出Aca I-C、Cja I-C、Ru I-C和TR3 I-C四个系统进行进一步分析 (图1D)。尽管这四个系统Cas3和Cas8c蛋白序列与Dvu I-C系统相比相似度均低于37%，但仍存在高度保守的空间结构特征，这表明蛋白质结构保守性可能在维持Cas蛋白功能过程中发挥关键作用 (图1E)。

图1 系统性挖掘鉴定出多样化的Type I-C系统

为了鉴定4个Type I-C系统的编辑活性，研究团队通过构建Cas蛋白以及crRNA的表达载体 (图2A)，在玉米原生质体中靶向PSY1和PDL1两个基因进行检测，发现Aca I-C和Cja I-C能够诱导大片段基因组缺失，而Ru I-C和TR3 I-C在这两个靶点上未表现出明显编辑活性 (图2B,C)。进一步分析表明，Aca I-C和Cja I-C在玉米7个靶点上平均编辑效率可达到47.41%和44.89%，与Dvu I-C系统 (51.79%) 相当 (图2D)。此外，基于Aca I-C和Cja I-C系统开发的Aca-ABE和Cja-ABE，实现了在玉米基因组中A-to-G的碱基替换，最高编辑效率分别为2.48%和9.51%，且几乎不产生非预期插入缺失突变 (图2E,F)。在稳定转基因玉米中，通过靶向GA20ox3基因，Aca I-C和Cja I-C系统诱导的T0代植株编辑效率分别为46.30%和23.81%。进一步通过自交获得T1代材料，Aca I-C系统诱导编辑的玉米植株株高显著降低(图2G,H)。此外，在玉米原生质体和转基因植株中，基于随机选择的靶点分析，均未检测到脱靶。上述结果表明，Aca I-C和Cja I-C系统不仅能够实现玉米中的高效大片段基因组敲除，还可以开发碱基编辑工具，为植物基因组精准改良和作物育种提供新的技术平台。

图2 Type I-C系统在玉米中的实验验证

来源: The Crop Journal