将大片段DNA乃至完整基因精准插入基因组的特定位置，是基因编辑中最具价值的能力之一。在作物育种中，将整套功能基因或多基因模块一次性整合到表达稳定、遗传可控的基因组安全位点，可快速引入抗病、抗除草剂及抗虫等复合性状；在疾病治疗领域，将治疗性基因定点插入基因组安全港位点，不仅能保障其长期稳定表达，更能有效规避随机插入所致的致癌风险；在合成生物学领域，将由多个元件构成的合成通路定点写入染色体，可避免随机插入导致的表达失衡与遗传不稳，使人工设计的代谢途径在底盘中长期可控运行。然而，如何把大片段DNA精准、高效且稳定地插入指定位置，长期以来始终是制约上述应用的关键瓶颈。
北京齐禾生科生物科技有限公司研究团队近日在大型丝氨酸重组酶研究中取得新进展。这项工作将基因精准插入从″只优化工具″推进到″工具与DNA接口协同设计″，为人类疾病治疗及作物高价值性状的大片段DNA高效、稳定导入提供了可扩展的底层技术路径。相关研究成果″Engineered genomic attachment sites for site-specific recombinases enable high-efficiency integration in plants and human cells″已发表于Nature Biotechnology。团队通过对重组酶识别位点进行理性设计，获得了一批活性显著提升、可用于大片段DNA精准插入的新型位点，并将由attB(V111)位点构成的代表性组合命名为V111-LOCI（engineered Landing site for Optimized Cargo Integration）。利用V111-LOCI在人基因组安全港位点插入细胞基因治疗相关表达盒的效率达到约30%，在中国骨干亲本缘88S水稻稳定转化材料中定点插入除草剂抗性基因表达盒的效率达到24%。
V111-LOCI 示意图
不只优化″工具″，也优化DNA上的″接口″
大型丝氨酸重组酶是可将功能DNA片段精准整合到预定位置的″DNA插入工具″。此前国内外研究团队的优化工作多聚焦于改造重组酶蛋白本身，齐禾生科团队则提出同步优化其DNA识别位点。团队基于天然att位点进行理性重排，构建嵌合att位点，并从中筛选出可显著提升Bxb1重组酶对大片段DNA插入效率的新位点。
在水稻中实现抗除草剂基因靶向插入
作物遗传改良常需导入大片段功能表达盒，其精准高效插入是技术实用化的关键。在水稻实验中，团队开发了一体化递送策略，利用V111-LOCI在靶位点精准插入了内源除草剂抗性表达盒，24%的阳性再生植株检测到稳定插入。二代与三代测序联合分析表明，该插入事件为完整且精确的定点整合，未检测到嵌合编辑。进一步对下一代植株的遗传分离分析证实，已成功获得纯合插入株系。经多层次验证，该位点不仅提升插入效率，更为大片段DNA在作物基因组中的精准、完整、稳定导入提供了有力支撑。
一体化递送，V111-LOCI创制除草剂抗性水稻（文章中Fig. 2e-g）
为精准育种提供新的底层工具选择
从产业化角度看，这项工作提供的并非只是一个单一位点或单一蛋白，而是一种可扩展的设计思路，即通过系统优化重组酶及其DNA识别位点，提升大片段DNA精准插入的效率与质量。
未来，这一策略有望拓展至更多大型丝氨酸重组酶体系，并服务于作物重要性状改良等育种需求。研究中人源细胞的结果也提示，该类技术在细胞工程和基因工程领域具有进一步探索的应用潜力，相关方向仍需针对递送效率、安全性和具体应用场景开展持续验证。
来源: 齐禾生科
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