中国农业大学研究团队发现兼具预防和治疗的杀菌剂靶标 Pmk1

近日，植物保护学院刘俊峰、王冬立团队在爱思唯尔旗下《国际生物大分子杂志》发表研究论文 Pmk1 as a target for both protective and curative treatments against pathogenic fungi ，报道了Pmk1可作为兼具预防和治疗功能的杀菌剂靶标。目前，仅有少数杀菌剂（如春雷霉素和稻瘟灵）兼具预防和治疗作用。春雷霉素靶向细菌70S核糖体，稻瘟灵可能靶向一种磷脂合成相关的甲基转移酶。因此，Pmk1可作为开发兼具预防和治疗作用杀菌剂另一个罕见靶点。

化学防治仍是稻瘟病等植物真菌病害防控的核心策略，但抗性和残留等问题迫切需要开发具有新型作用机制的化合物。丝裂原活化蛋白激酶级联反应由依次激活的MAPKKK、MAPKK和MAPK组成。真菌有三种MAPK（Mps1、Pmk1和Osm1），其中Mps1已被证明可作为杀菌剂靶标。Pmk1不仅对附着胞的形成至关重要，还调控侵染菌丝在寄主组织内的扩展，但其是否可作为杀菌剂靶标尚未见报道。

为探究Pmk1是否可作为杀菌剂靶点，使用药明康德的DNA编码化合物库进行抑制剂筛选，共获得13种可能选择性结合Pmk1的化合物。分析这些化合物的特性，最终选择化合物A59并合成（图1）。SPR实验表明A59与Pmk1之间的结合解离常数为42.5μM，证实A59能够与Pmk1结合。酶活实验显示A59能够抑制Pmk1的活性。

图1 A59小分子的结构式

Pmk1在稻瘟菌附着胞形成和侵染菌丝扩展过程中起关键作用，抑制Pmk1会导致侵染菌丝被困在单个植物细胞内，并引发活性氧的爆发。将A59应用于稻瘟菌防治时会产生与抑制Pmk1相同的表型，表明该化合物通过在体内靶向Pmk1，对抵御稻瘟菌侵染水稻以及大麦具备双重防护效应——既能在侵染前期发挥保护作用，又能在侵染后期展现治疗活性（图2）。

图2 体内实验表明 A59 具有保护和治疗作用

随后，预测了Pmk1的三维结构，并采用分子对接预测A59在Pmk1上的结合位点（图3A）。结果显示A59与Pmk1的催化位点结合，这与酶活实验结果一致；Pmk1的氨基酸残基Q104等与A59形成四个氢键，V30等与A59形成疏水相互作用（图3B）。根据分析结果制备了突变体蛋白，发现突变体与A59的相互作用降低或消失，支持计算得出的Pmk1-A59复合物模型。

图3 化合物A59与Pmk1结合位点的分析

由于A59含有三个手性碳原子，决定对其进行修改以评估其异构体（图4）。发现对哌啶基团中的手性碳原子进行替换对Pmk1的活性没有显著影响，改变第二个手性碳原子对Pmk1的活性没有显著影响，而改变第三个手性碳原子或同时改变第二和第三个手性碳原子则显著影响活性。这些结果表明，手性碳原子的构型对Pmk1的活性至关重要。

图4 A59的异构体

综上，Pmk1在稻瘟菌侵染过程中对植物体内侵染菌丝的扩展至关重要，但其是否可作为杀菌剂的靶点尚不明确。在本研究中，通过筛选和验证特异性靶向Pmk1的化合物A59，证明了Pmk1可作为开发兼具保护和治疗作用的杀菌剂的潜在靶点，并提供了A59作为先导化合物。鉴于Pmk1在植物病原菌中的保守性，该蛋白具有作为广谱杀菌剂靶标的潜力。

来源: 中国农业大学新闻网