2025年6月1日，贵州大学绿色农药全国重点实验室博士生杨玉嫒作为第一作者，宋宝安院士作为通讯作者，在国际知名学术期刊Journal of Advanced Research(中科院一区TOP，Impact Factor = 11.4，CiteScore = 21.6)上在线发表″Antiviral activity and mechanism of purine morpholine nucleoside analogues incorporating a sulfonamide fragment″为题的研究论文。
团队以嘧啶核苷和嘌呤核苷作为核心母体结构，通过引入磺胺基团作为药效团，设计并高效合成了两类新型核苷类衍生物：64个磺胺取代嘧啶核苷类衍生物和38个磺胺取代嘌呤核苷类衍生物，成功发现磺胺结构单元的嘌呤吗啉核苷类小分子抑制剂C1。机制研究揭示了其通过靶向PMMoV CP 13位的酪氨酸残基(Tyr13)，抑制I3QHX5(Adenosylhomocysteinase)与PMMoV CP之间形成的相分离，对凝聚体具有破坏作用，从而干扰了病毒粒子的形成，实现抗辣椒轻斑驳病毒的目的。研究获得了国家基金重点项目(32330087)的支持。
辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottled virus, PMMoV)是一种RNA病毒，是辣椒作物中最具破坏性的病原体之一，由于其高传染性和在土壤中稳定存在，这种病毒作为水生环境和水处理系统中人类粪便污染的潜在病毒指示物越来越引起人们的关注。最新研究表明，PMMoV在粪便中的检出率与宿主特异性免疫应答存在统计学关联，揭示该病毒可能对人类健康具有潜在致病风险。鉴于PMMoV在污染种子、植物残体、土壤及水体中表现出极强环境稳定性，其对生态安全、食品安全及公共健康的潜在威胁正受到日益广泛的关注。当前针对PMMoV的防控策略主要依赖抗病品种筛选，缺乏有效防治该病毒的药剂。因此，基于天然产物设计，合成出一种高效、低毒、环境友好的抗病毒剂来抑制PMMoV并揭示其分子靶标具有重要的意义。
胞嘧啶核苷类药物是对天然核苷(酸)的碱基或糖基部分进行修饰，或者同时对碱基和糖基进行双重修饰，可得到核苷类似物或核苷酸类似物。近十多年来，嘧啶类核苷抗病毒药物发展迅速，以胞嘧啶为中间体创新出抗病毒活性的化合物不计其数，它具有广泛的抗病毒活性，如HIV，HCV，H5N5，HCMV，DENV等。同样，在农业领域，胞嘧啶核苷类药物类衍生物也展现出了抗病毒生物活性，嘧肽霉素和宁南霉素均成为抗病毒剂代表品种。然而，尽管核苷类药物在农业领域具有巨大的应用潜力，但关于其抗植物病毒的创新研究却仍然相对较少。
该研究聚焦于PMMoV，以医药及农药领域具有广泛生物活性的胞嘧啶核苷和嘌呤核苷为先导化合物，基于活性片段拼接策略，通过引入磺胺结构单元，设计并合成了2个系列含磺胺结构单元的胞嘧啶核苷类衍生物及1个系列含磺胺结构单元的嘌呤核苷类衍生物。即2-(乙酰氧基甲基)-6-(5-氧代咪唑[1,2-c]嘧啶-6(5H)-基)-5-(取代苯磺酰胺基)四氢-2H-吡喃-3,4-二乙酸酯类衍生物(A)、2-(乙酰氧基甲基)-6-(8-取代-5-氧代咪唑[1,2-c]嘧啶-6(5H)-基)-5-(取代苯磺酰胺基)四氢-2H-吡喃-3,4-二乙酸酯类衍生物(B)和2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-取代-6-吗啉基-9H-嘌呤-9-基)-5-((取代苯基)磺酰胺基)四氢-2H-吡喃-3,4-二乙酸酯类衍生物(C)。以宁南霉素为对照药剂，采用半叶枯斑法，测试了含磺胺结构单元的胞嘧啶核苷类衍生物A1-A32、含磺胺取代的胞嘧啶核苷类衍生物B1-B32、含磺胺结构单元的嘌呤核苷类衍生物C1-C38对PMMoV的抑制活性，研究发现化合物C1对PMMoV表现优异的抑制活性，其EC50值为37.0 μg/mL，优于对照药剂宁南霉素(68.9 μg/mL)。进一步研究发现，化合物C1与PMMoV CP具有优异的结合力，其Kd值为1.50 μM，优于对照药剂宁南霉素(13.59 μM)。为了深入探究目标化合物抗PMMoV的作用机制，研究团队以C1为模型化合物，通过在嘌呤环结构中引入炔基基团，成功合成小分子探针化合物C2。活性测定结果表明，C2对PMMoV的抑制活性与C1相当，且均优于对照药剂宁南霉素，表明C2可作为小分子探针用于靶蛋白捕获。通过ABPP、浓度依赖性及竞争性抑制实验及MST分析，明确PMMoV CP为C1的直接作用靶标。进一步通过分子对接技术筛选C1作用在PMMoV CP上的关键作用位点，发现C1与PMMoV CP相互作用的关键氨基酸位点为13位和140位的酪氨酸(Tyr13、Tyr140)。为解析这两个位点在病毒侵染过程中的功能，构建了pCB-GFP-PMMoV CPY13A和pCB-GFP-PMMoV CPY140A的侵染性克隆，通过Western blot和RT-qPCR技术，分别检测其CP蛋白及CP基因在7、14及21 dpi时的表达水平。结果显示，Tyr140突变为丙氨酸(Y140A)可延缓病毒的系统侵染进程，而Tyr13突变为丙氨酸(Y13A)则显著抑制病毒的系统侵染，表明PMMoV CP第13位氨基酸的改变对病毒侵染过程具有决定性影响。基于上述关键发现，本研究拟通过Co-IP MS及RNA-seq，分析PMMoV CP野生型与Y13A突变体在互作蛋白层面的差异，以期阐明导致两者侵染表型差异的分子机制。
基于RT-qPCR技术对Co-IP MS及RNA-seq筛选获得的蛋白进行差异表达验证，成功鉴定出5个候选蛋白(A0A248QEL2、B1PSM0、I3QHX5、LOC109221810、A2IBL2)。为解析PMMoV CP与PMMoV CPY13A在蛋白互作网络中的差异，采用LCA及BiFC进行蛋白互作验证。LCA结果表明，PMMoV CP与PMMoV CPY13A均能与上述5个候选蛋白发生互作；而BiFC分析表明，仅A0A248QEL2、B1PSM0及I3QHX5可与PMMoV CP和PMMoV CPY13A形成特异性互作，而LOC109221810与A2IBL2未检测到荧光信号。值得关注的是，尽管PMMoV CP和PMMoV CPY13A均能与A0A248QEL2、B1PSM0及I3QHX5互作，但在与I3QHX5的互作过程中呈现显著差异：PMMoV CP与I3QHX5互作时诱导形成大量生物分子凝聚体，而PMMoV CPY13A与I3QHX5互作则无凝聚体产生。通过融合-裂变动态观察及FRAP技术分析，证实PMMoV CP与I3QHX5形成的凝聚体在体内外均具备LLPS特性，而PMMoV CPY13A丧失了诱导LLPS的能力，提示该凝聚体可能参与病毒侵染促进过程。进一步研究发现，在30、36及42 hpi添加小分子化合物C1，可显著影响PMMoV CP，PMMoV CPY13A与I3QHX5的互作效率及凝聚体形成数量。Western blot及RT-qPCR检测进一步证实，沉默I3QHX5导致PMMoV CP蛋白积累量及病毒RNA水平显著降低，表明I3QHX5是病毒复制的正调控因子，PMMoV可通过调控该蛋白促进自身增殖。上述结果共同表明，C1发挥抗病毒活性的分子机制可能与抑制CP介导的LLPS凝聚体形成密切相关。
图1 化合物C1抑制PMMoV复制的可能作用机制模式图
该发现为解析病毒利用宿主相分离机制完成生命周期提供了新视角，并进一步支持靶向CP介导的LLPS作为抗病毒策略的合理性。
来源: 中化新网